ВЕСТЕРН БЛОТ ЕКСТРАКТУ АЛЕРГЕНА ЯК ДОДАТКОВИЙ ЛАБОРАТОРНИЙ ІНСТРУМЕНТ В ОЦІНЦІ ТЯЖКОСТІ СЕНСИБІЛІЗАЦІЇ І ВИБОРІ ЗАСОБИ АСИТ ПРИ АЛЕРГІЇ
ЛОБАНОВА О.І., КРАВЕЦЬ Т.В., ГАРЕЄВ О.Л., НЕЩЕРЕТ Л.С., КУРТОВА М.М.
Лабораторія «Сіместа», м. Одеса
Алергічні захворювання являють собою на сьогоднішній день серйозну медико-соціальну проблему, вирішенням якої займаються кращі науково-дослідні центри світу [1]. За роки роботи дослідникам вдалося розібратися в механізмах розвитку алергологічних захворювань, а впровадження алерген-специфічної імунотерапії (АСІТ) у широку клінічну практику дозволило добиватися ефекту десенсибілізації, а не тільки тимчасово пригнічувати симптоми хвороби [2, 3].
Усталена практика роботи алергологів за затвердженими протоколами і рекомендаціям дозволяє ефективно використовувати узагальнений клінічний досвід, представлений у методичних посібниках, що, без сумніву, допомагає уникнути грубих помилок, як і діагностиці, і у виборі терапії [4]. Тим не менш, уніфікований підхід досить обмежений, так як не враховує індивідуальні особливості імунореактивності організму пацієнта, коморбідну патологію, наявні ускладнення, умови зовнішнього середовища і безліч інших змінних факторів, що знижує ефективність лікувальних втручань, що проводяться при алергічних хворобах [5] . Очевидний той факт, що кожна людина індивідуальна за біохімічними, імунофізіологічними, нейроендокринними та іншими параметрами, що певним чином відбивається на алергічній реакції, що розвивається. Відомо, що в деяких випадках ці особливості мають принципово важливе значення, що обґрунтовує необхідність застосування персоніфікованого підходу до алергодіагностики та імунотерапії, який неможливий без поглибленого молекулярного аналізу в алергології [6].
Проблема об’єктивної обмеженості стандартних лабораторних маркерів алергічних захворювань людини
Актуальність, затребуваність персоналізованого підходу в алергології давно стала очевидним фактом. На даний момент пройшла велика робота, результатом якої стала можливість виявляти сенсибілізацію до деяких компонентів екстрактів алергенів, і тим самим персоналізувати подальшу імунотерапію. Однак, слід визнати, що доступні на ринку лабораторних досліджень маркери є лише окремими елементами з відомого переліку алергенних компонентів, які складають цілісний екстракт алергену. Тобто, діючі діагностичні тести в алергології часто не дозволяють ідентифікувати всі відомі молекулярні компоненти екстракту алергену, які могли призвести до сенсибілізації та появи симптомів алергії у пацієнта, що може знижувати ефективність алерген-специфічної імунотерапії (АСІТ). Щоб уникнути таких помилок необхідно розширити перелік рекомендованих алергологічних тестів, кілька відступивши від шаблонів і допустивши персоніфікований пошук алергенних компонентів екстракту алергену, актуальних для алергічної реакції в конкретному клінічному випадку. компонентів екс-тракту алергену Cultivated Rye (культивується жито) дає наочне уявлення про кількість алергенних компонентів, що містяться в ньому, деякі з яких не входять у діагностичні алергологічні панелі, що використовуються нині (рис. 1). З цього прикладу стає очевидним факт, що таких компонентів більше, ніж описано в літературі, і тим більше – ніж доступних як маркерів лабораторної діагностики в комерційних алергологічних тестах.
Мал. 1. Фото результату електрофоретичної розгону компонентів екстракту алергену Cultivated Rye, що вказує на наявність невідомих алергенних компонентів, які могли зумовити сенсибілізацію в індивідуальному порядку у конкретного пацієнта
В іншому прикладі при вивченні Ambrosia artemisifolia (амброзія полинолиста) фахівцям на даний момент вдалося виділити, описати і класифікувати дванадцять алергенних компонентів (табл. 1). З цього числа доступними в лабораторній алергологічній практиці досі залишаються лише Аmb a 1 і Аmb a 4. Сенсибілізація до інших компонентів екстракту амброзії лабораторними дослідженнями не оцінюється, що може бути причиною діагностичних помилок, що веде до неефективності алерген-специфічної імунотерапії у пацієнтів, сенсибілізованих до маловивчених алергенних компонентів амброзії. Таким пацієнтам необхідний індивідуальний підхід до алергодіагностики не за шаблоном (тільки Аmb a 1 і Аmb a 4), а з вивченням повного переліку потенційно небезпечних алергенних компонентів за допомогою додаткових лабораторних методів.
Список відомих аллергенних компонентів екстракту Ambrosia artemisiifolia
Просунувшись у питанні вивчення властивостей алергенних компонентів та їх класифікації, слід визнати, що все ще залишається велика кількість тих з них, які досі не вивчені і належним чином не систематизовані. Неможливість отримати інформацію про такі компоненти не скасовує ймовірності, що ці компоненти можуть викликати сенсибілізацію у конкретного пацієнта. Тести, що використовуються сьогодні в лабораторній практиці, суворо регламентовані виявленням сенсибілізації тільки до деяких доступних маркерів, і не охоплюють всього переліку потенційно небезпечних компонентів, які можуть бути причиною розвитку алергії. (WB) білків, у тому числі компонентів екстрактів алергенів. Виносячи цю методику за рамки виключно досліджень, впровадивши її в практику клінічної лабораторії, з’являється можливість дати лікаря клініциста нехай не вичерпний, але клінічно достатній обсяг інформації для адекватної персоніфікованої оцінки причини алергії, тяжкості стану хворого та вибору оптимальних засобів для проведення АСІТ.
Доступний інструмент лабораторної діагностики алергічних захворювань – WB екстракту алергену
За інформативністю WB екстракт можна зіставити з IFA клітин Hep 2 у діагностиці аутоімунних захворювань. Виявлене флюоресцентне світіння на субстраті Hep 2 клітин або його відсутність дає лікарю алергологу неоціненну, вичерпну інформацію про наявність або відсутність аутоантитіл до тих чи інших ядерних, цитоплазматичних, оболонкових компонентів клітин тканин і органів пацієнта. Отримавши результат у такому скринінгу, лікар має вектор, рухаючись по якому, можливе цілеспрямоване призначення додаткових, уточнюючих досліджень, застосовуючи методики ELISA та ІмуноКап. Повертаючись до екстракту WB, аналогія з IFA Hep 2 очевидна. WB забезпечує відбиток всіх білків, присутніх в екстракті алергену, на спеціальному папері після розгонки цих білків в електрофоретичній камері, що під дією слабкого постійного електричного струму ранжує білки по молекулярній масі. Технологія виготовлення WB давно відпрацьована, загальнодоступна, вимагає мінімального спеціального обладнання. Вона легко освоюється персоналом. Отже, існує інструмент, що дозволяє отримати матрицю, що містить всі білки конкретного екстракту алергену з їх молекулярними масами, за допомогою якої можливо виявити наявність або відсутність сенсибілізацію організму пацієнта до кожного з компонентів екстракту алергену. Отримана інформація за допомогою WB екстракту алергену не суперечить жодному принципу, що використовується в молекулярній алергології сьогодні. При цьому вона розширює уявлення про стан хворого, надає більш повну, цілісну картину сенсибілізації, дає можливість адекватно визначитися з причинними алергенними компонентами та оцінити тяжкість захворювання, а також – точніше підібрати засіб для АСІТ. були отримані приклади результатів екстракту WB амброзії. Вони були інкубовані з сироватками шести пацієнтів, у яких виявлена в попередніх дослідженнях сенсибілізація до амброзії. Сьомий трек (крайній правий) – сироватка пацієнта без сенсибілізації до амброзії як контроль (рис. 2, 3)
Мал. 2. Результати проведення WB екстракту амброзії у семи пацієнтів, що дозволяють оцінити повну картину сенсибілізації до алергенних компонентів екстракту.
Мал. 3. Результати аналізу даних WB екстракту ам-брозії комп’ютерною програмою CLIQS
Аналізуючи отримані результати, можна назвати таке. Пацієнт, чия сироватка розташована по другому треку, сенсибілізований до єдиного компонента амброзії – Amb a 1. Це підтвердилося в «класичному» тесті, де був присутній маркер Amb a 1 і молекулярна маса 37,5 кДа відповідає цьому компоненту (табл. 1). Оптимальний вибір АСИТ для цього пацієнта, враховуючи профіль сенсибілізації, – моновакцина на основі Amb a 1 У пацієнта, чия сироватка в третьому тре-ку, – є одночасна сенсибілізація до десяти компонентів екстракту амброзії. Пацієнт по четвертому треку – сенсибілізація до дев’яти компонентів. Треба визнати, що така інформація не може бути отримана при використанні «класичних» методик лабораторної діагностики в алергології. Це може зумовити помилки у виборі засобу для АСІТ. Обмежуючись визначенням реакцій лише до стандартних Amb a 1 та Amb a 4, лікар-алерголог залишається у невіданні щодо справжнього стану хворого у багатьох нестандартних клінічних випадках. Слід звернути увагу, що частина компонентів, що викликають сенсибілізацію у пацієнтів по 3,4-му трекам, навіть не описані і не класифіковані в сучасній алергології; їх навіть немає серед відомих дванадцяти компонентів екстракту амброзії, розміщених у табл. 1. Однак сенсибілізацію до цих компонентів дозволяє виявити WB, а надалі за допомогою цього ж методу можна перевірити вакцину, що планується для АСІТ, на предмет наявності таких же білків для вибору оптимального засобу десенсибілізації. Ці можливості виводять аллергодіагностику та імунотерапію на інший, якісно новий рівень. Отримані дані за допомогою WB про полісенсибілізацію у даного пацієнта повинні направляти клініциста при виборі адекватного засобу для АСІТ у бік не монокомпонентної, а екстрактної полікомпонентної вакцини.
Узагальнені результати екстракту WB амброзії у семи пацієнтів, що дозволяють оцінити повну картину сенсибілізації до алергенних компонентів екстракту
Звернувши увагу на частоту прояву сенсибілізації до компонента з молекулярною масою 25 кДа по 3,4,5,6-му трекам (рис. 2), можна зробити припущення, що має місце реакція на один із трьох CCD-маркерів – бро-мелаїн. Це підтверджується результатом, отриманим після обробки досліджуваних сироваток крові CCD-блокером, – sIgE до бромелаїну були пов’язані, і при повторному тестуванні компонент з молекулярною масою 25 кДа не проявився. Нижче наведено фото результату повторного дослідження сироватки пацієнта по 6-му треку до (ліворуч) і після (праворуч) обробки ССD-блокером (рис. 4).
Результат дослідження для пацієнта, чия сироватка по 5-му треку після обробки CCD-блокером була скоригована, слід визнати його хибнопозитивним. Що стосується даних по сьомому треку, то компонент з молекулярною масою 38,4 кДа є Amb a 1, а компонент 48,7 кДа може бути Amb a 12 (табл. 1). Вираженість реакції за першим компонентом дає підстави лікарю-клініцисту при виборі засобу для АСІТ обмежитися моновакциною на основі Amb a 1.
Мал. 4. Результати WB екстракту амброзії до (ліворуч) та після (праворуч) обробки ССD-блокером
WB та електрофорез екстрактної вакцини АСІТ для підбору оптимального підходу до десенсибілізації
Застосовуючи ті ж технологічні прийоми з використанням WB, можна оцінити білковий склад екстрактної вакцини, яка планується або вже використовується пацієнтом як АСІТ. Треба визнати факт того, що багато виробників екстрактних алергологічних вакцин не надають повну інформацію про склад вакцини, обмежуючись вказівкою того, що вакцина екстрактна, не модифікована, стандартизована біологічно, в деяких випадках – стандартизована за білком. Що таке не модифікований екстракт? Це очищена від природних забруднень сировина (наприклад, пилок берези), піддана досить простим способам екстракції. Всі компоненти пилку, що перейшли в отриманий розчин, і є екстрактною вакциною. Що таке біологічна сертифікація? Суть відповіді зводиться до того, що кількісні характеристики лікарського засобу визначаються не в одиницях маси, а ефектом, який виробляє цей лікарський засіб. Лікар, призначаючи екстрактну вакцину, зазвичай не має вичерпної інформації ні по діючій речовині, ні по дозування цієї речовини. Застосування WB дозволяє детально вивчити вакцину по білковому складу та сформувати обґрунтовану думку про доцільність призначення саме цього препарату конкретному пацієнту з певним профілем сенсибілізації
Приклад із практики
Мал. 5. Результати лінійних блотів пацієнта з алергією на пилок берези
Вижче наведено показовий клінічний випадок. В анамнезі у пацієнта була алергія на пилок берези. Він використовував екстрактну вакцину берези для десенсибілізації. Для уточнення діагнозу нами були використані такі лінійні блоти: екстрактний респіраторний і мультиплексний пилковий (рис. 5).
З отриманого обсягу інформації для спрощення аналізу зупинимося тільки на сенсібілізації до берези. Як видно із рис. 5, при слабкій реакції на екстракт берези – t3 (рівень 0-+), відзначається висока вираженість сенсибілізації до компонента Bet v 1. Такий па-радокс має відомі пояснення. Після цього ми взяли зразок екстрактної вакцини Betula verrucosa (берези повислої), яку використовував пацієнт з метою десенсибілізації. При проведенні електрофорезу цієї вакцини було отримано спектр білків, що входять до її складу (рис. 6, табл. 3).
Мал. 6. Спектр білків вакцини Betula verrucosa (WB). Трек 1 – маркери молекулярних мас. Трек 2 – компоненти екстрактної вакцини берези
Склад алергічних компонентів Betula verrucosa
Використовуючи дані про молекулярні маси компонентів екстракту берези (таб. 3), у вакцині ідентифікували компонент Bet v 1, який має молекулярну масу 17 кДа.
Мал. 7. Результат інкубації сироватки хворого з екстрактом WB берези (1-й трек). Другий трек – контроль, постановка з сироваткою без сенсибілізації до берези. 3-й трек – маркери молекулярної маси
Визначався також білок з молекулярною масою в 30 кДа, але серед описаних алергенних компонентів берези такий компонент на даний момент не значиться. Білок, найближчий до нього за масою, – 35 КдА – є компонентом Bet v 6. Для пацієнта цей факт дуже важливий, оскільки він має братися до уваги при доборі АСІТ. Крім того, було виявлено додаткову наявність білків з молекулярною масою більше 50-ти кДа, яку не враховували при виборі засобу АСІТ. Наступним кроком було виготовлення WB екстрактної вакцини Betula verrucosa, яку за призначенням лікаря пацієнт регулярно приймає. Нижче наведено результат інкубації сиворотки хворого з WB екстракту берези (рис. 7). Згідно з цими результатами виявлена сенсибілізація до Bet v 1, що має молекулярну масу на рівні 17 кДа, що відповідає результату, отриманому при використанні лінійного блота. Простежувалася також сенсибілізація до білків з масою 30-35 кДа. Слід звернути увагу на той факт, що білки в такому діапазоні не описані як алергенні компоненти, у зв’язку з чим відсутні в переліку маркерів класичної лабораторної діагностики. Добре відомий компонент Bet v 6 з молекулярною масою 35 кДа також недостатній при стандартній діагностиці в алергологічної практиці. Зіставляючи результати, отримані при використанні WB екстракту берези з білковим складом застосовуваної екстрактної алерговакцини, можна прийти до закономірних висновків. у пацієнта була виявлена сенсибілізація. Цей факт підтверджує уявлення про потенційну ефективність цієї вакцини в цьому конкретному випадку. Що стосується білків 30-35 кДа, до яких у WB екстракту берези виявлена сенсибілізація у пацієнта, то у вакцині такі білки також присутні, що є позитивною властивістю. Але в препараті також присутні, причому у більшій кількості, і білки з молекулярною масою менше 30 кДа. Ці компоненти можна розцінювати як баластові для цього конкретного пацієнта, оскільки сенсибілізація до них у того відсутня. Те саме можна сказати і про компоненти вакцини з молекулярною масою більше 50 кДа. Слід припустити, що при тривалому прийомі саме цієї вакцини у пацієнта з сенсибілізацією до Bet v 1 і білків з масою 30-35 кДа існує ризик формування додаткової небажаної сенсибілізації до білків з масою менше 30 кДа і більше 50-ти кДа. Тому застосована вакцина не може вважатися оптимальною в даному випадку, оскільки поряд з очевидною користю, вона може призвести до додаткової сенсибілізації та посилення проявів алергії. Саме високоточний метод WB, що надає розширену інформацію про білковий склад, дозволив розібратися в складній клінічній ситуації і виправити допущені помилки при стандартному, а не персоніфікованому підборі кошти для проведення АСІТ.
ВИСНОВКИ
Хоча впровадження стандартів в алергодіагностику призвело до певного прогресу у виявленні та лікуванні алергії, згідно з сучасним уявленням кращим є персоніфікований підхід до ідентифікації причинних алергенних компонентів і підбору засобів для проведення АСІТ. Персоніфікований підхід в алергології неможливий без повного аналізу переліку білків, до яких є сенсибілізація у конкретного пацієнта. На даний момент з’явилася перспективна можливість точно виявляти сенсибілізацію до всіх компонентів екстракту алергену за допомогою методу WB. Це дозволяє правильно оцінити тяжкість сенсибілізації і адекватно підібрати засіб для АСІТ навіть у складних, нестандартних клінічних випадках. Крім цього, WB дозволяє визначити доцільність призначення моно або екстрактної вакцини для АСИТ у конкретного пацієнта згідно з вивченим індивідуальним профілем сенсибілізації до алергенних компонентів того чи іншого екстракту. Але цим не обмежуються переваги WB в алергології. На даний момент став доступний також WB екстрактних вакцин, що плануються до застосування як АСІТ. Порівняльний аналіз результатів, отриманих при використанні WB екстракту алергену, зі спектром білків екстрактної вакцини, виявленим при електрофорезі вакцини, дозволяє оцінити доцільність призначення цього вакцинного препарату даному пацієнту і уникнути ряду лікувальних помилок. Впровадження зазначених прогресивних лабораторних методик у сучасну алергодіагностіку дозволить суттєво підвищити якість медичних послуг в алергології та досягти кращих результатів лікування алергії за допомогою АСІТ.
СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ
- Мітін Ю.А. Лабораторна діагностика алергічних захворювань. Методичні рекомендації. Санкт-Петербург. – 2017. – 109 с.
- Новик Г.А. Механізми алергічних реакцій та методи алергогообстеження в клінічній практиці (діагностика та диференційний діагноз). Навчально-методичний посібник за редакцією з.д.н. РФ, професора І.М. Воронцова СПб.: Видання ДПМА. – 2004. – 76 с
- Canonica Walter та ін. Консенсус WAO-Aria-GA LEN по молекулярній діагностиці алергій. https://elibrary.ru/item.asp?id=21987599
- EAACI Global Atlas Allergy. https://www.eaaci.org/globalatlas/GlobalAtlasAllergy.pdf
- EAACI Molecular Allergology User’s Guide. https://www.eaaci.org/documents/Molecular_Allergology-web.pdf
- Kleine-Tebbe J., Thillo J. Molecular allergy diagnostics з використанням IgE довжиною визначень: методологічних і практичних умов-ефектів для використання в клініці // Аллерго J. Int. – 2015. – Vol. 24. – P. 185-197
РЕЗЮМЕ
ВЕСТЕРН БЛОТ ЕКСТРАКТУ АЛЕРГЕНА ЯК ПРОГРЕСИВНИЙ ЛАБОРАТОРНИЙ ІНСТРУМЕНТ В ОЦІНЦІ ТЯЖКОСТІ СЕНСИБІЛІЗАЦІЇ ТА ВИБОРУ ЗАСОБИ АСИТ ПРИ АЛЕРГІї
Лобанова Є.І., Кравець Т.В., Гарєєв А.Л., Нещерет Л.С., Куртова М.М.
Лабораторія «Сіместа», г. Одеса
Алергічні захворювання є на сьогодні серйозною медико-соціальною проблемою, вирішенням якої займаються найкращі науково-дослідні центри світу. Хоча впровадження стандартів в алергодіагностику призвело до певного прогресу у виявленні та лікуванні алергії, згідно з сучасним уявленням кращим є персоніфікований підхід до ідентифікації причинних алергенних компонентів і підбору засобів АСИТ. Персоніфікований підхід в алергології неможливий без повного аналізу переліку білків, до яких є сенсибілізація у конкретного пацієнта. На даний момент з’явилася перспективна можливість точно виявляти сенсибілізацію до всіх компонентів екстракту алергену за допомогою методу вестерн блоту. Це дозволяє правильно оцінити тяжкість сенсибілізації і адекватно підібрати засіб АСІТ навіть у нестандартних клінічних випадках. Вестен блот дозволяє визначити доцільність призначення рекомбінантної або екстрактної вакцини для АСИТ у конкретного пацієнта згідно з профілем сенсибілізації. На даний момент став доступний також електрофорез екстрактних вакцин, що плануються до застосування як АСІТ. Порівняльний аналіз результатів, отриманих при використанні вестен блоту екстракту алергену, зі спектром білків екстрактної вакцини, виявленим при електрофорезі вакцини, дозволяє оцінити доцільність призначення цього вакцинного препарату даному пацієнту і уникнути ряду лікувальних помилок. Впровадження зазначених прогресивних лабораторних методик в сучасну алергодіагностику дозволить суттєво підвищити якість медичних послуг в алергології і досягти кращих результатів лікування алергії.
SUMMARY
WESTERN BLOT OF ALLERGEN EXTRACT AS A PROGRESSIVE LABORATORY TOOL IN ASSESSING THE SEVERITY OF SENSITIZATION AND THE CHOICE OF ASIT FOR ALLERGIES
Lobanova K., Kravets T., Gareev A., Neshcheret L., Kurtova M.
Laboratory “Simesta”, Odesa
Allergic diseases are today a serious medical and social problem, the solution of which is being done by the best research centers in the world. And, indeed, we already have huge progress in understanding the mechanism of development of allergic complications, and the introduction of allergen-specific immunotherapy in wide clinical practice has allowed us to achieve the effect of desensitization, and not only temporarily suppress the symptoms of the disease.Although the introduction of standards in allergic diagnostics has led to some progress in the identification and treatment of allergies, according to modern concepts, a personalized approach to identifying caus-ative allergenic components and selecting ASIT is pre-ferred. A personalized approach in allergology is impossible without a complete analysis of the list of proteins to which there is sensitization in a particular patient. At the moment, there is a promising opportunity to accurately detect sensitization to all components of the allergen extract using the Western blot method. This allows you to correctly assess the severity of sensitization and to adequately choose an ASIT drug even in non-standard clinical cases. Western blot allows you to determine the feasibility of the appointment of a recombinant or extract vaccine for ASIT in a particular patient according to the profile of sensitization. Electrophoresis of extract vac-cines planned for use as ASIT has also become available at the moment. A comparative analysis of the results ob-tained using the western blot of an allergen extract with a spectrum of extract vaccine proteins detected by vac-cine electrophoresis allows us to evaluate the feasibility of prescribing this particular vaccine preparation to this patient and to avoid a number of medical mistakes. The introduction of these advanced laboratory techniques in modern allergy diagnostics will significantly improve the quality of medical services in allergology and achieve better allergy treatment results. Key words: western blot, allergy diagnosis, aller-gene-specific immunotherapy.