Helicobacter pylori

Особливості імунологічної відповіді у Helicobacter pylori-інфікованих хворих на хронічний гастрит.
Чуков С. З., В. Д. Пасічников

Ставропольська державна медична академія

(Features of the immune response for Helicobacter pylori-infected patients with chronic gastritis)

Досліджено 18 пацієнтів з H. pylori-асоційованим гастритом, діагностованим гістологічно. Методом вестерн-блот у сироватці крові визначали наявність специфічних IgG до 6 білкових антигенів H. pylori. Зіставляли гістологічні та серологічні дані. Результати дослідження дозволяють констатувати відмінності імунологічної відповіді, що супроводжується розвитком запального ушкодження слизової оболонки шлунка різного ступеня тяжкості при інфікуванні певними серотипами H. pylori.
Ключові слова: Helicobacter pylori, серотип, вестерн-блот метод, атрофія слизової оболонки шлунка.

Вступ

Helicobacter pylori – провідна причина розвитку активного хронічного гастриту. Він відіграє важливу роль у патогенезі виразки і раку шлунка [9].

На цей час вивчені численні чинники вірулентності H. pylori. Основні серед них – джгутики, продукція низки ензимів (уреази, супероксиддисмутази) та молекул клітинної адгезії. Крім цих факторів, властивих всім штамам H. pylori, низка факторів вірулентності продукується лише деякими з них. До них відносяться, зокрема, вакуолізуючий цитотоксин VacA та цитотоксинасоційований антиген CagA [18, 19].

Незважаючи на інтенсивні дослідження в усьому світі, питань та протиріч у цій галузі поки що залишається більше, ніж відповідей, і до однозначної характеристики відомих бактеріальних факторів вірулентності H. pylori ще далеко [8].

Відомо, що штами H. pylori, які продукують VacА-цитотоксин, виділяються частіше у пацієнтів з виразковою хворобою, ніж у хворих на хронічний гастрит.

Таким чином, продукція цитотоксину може бути причетна до розвитку виразки. Отже, цитотоксичні штами більш ульцерогенні, ніж нецитотоксичні. Встановлено також, що виділення штамів, що викликають вакуолізацію клітин in vitro, значно частіше спостерігається у хворих на виразку (і гістологічно виявлений гастрит) або атрофічний гастрит, ніж у хворих на хронічний поверхневий (неатрофічний) гастрит [14].

При вивченні хімічної структури VacА-цитотоксину виявилося, що він є білковим агрегатом масою 970 кДа, що містить субодиниці масою 67 кДа. N-кінцева послідовність токсину має деяку подібність із внутрішнім сегментом клітинної АТФази, відповідальної за іонний транспорт [6]. Цією схожістю можна пояснити формування градієнта рН у внутрішньоклітинних структурах, що в кінцевому підсумку призводить до вакуолізації епітеліоцитів з подальшою загибеллю і утворенням ерозивних і виразкових дефектів.

CagA – високоімуногенний протеїн масою 116-140 кДа, що коекспресується приблизно у 70% цитотоксинпродукуючих штамів H. pylori. Пацієнти, інфіковані цитотоксичними штамами та/або мають анти-CagA сироваткові антитіла, більш схильні до ризику розвитку активного хронічного гастриту з подальшим формуванням у слизовій оболонці шлунка атрофічних процесів, виразки та малігнізації.

Зв’язок між сироватковими анти-CagA антитілами та розвитком зазначеної патології підтверджений результатами численних досліджень. Зокрема T.L. Cover та співавт. [4] вказують, що анти-CagA виявляються в сироватці крові при дуоденальній виразці, раку шлунка та невиразкової диспепсії відповідно у 87,5, 76 і 56,4% хворих, а ген cagA, що контролює продукцію цитотоксинасоційованого протеїну CagA, виявляється при тій патології у інфікуючих штамів H. pylori відповідно у 81,3, 68 та 59% випадків.

Рухливість, обумовлена наявністю джгутиків, – важливий чинник вірулентності H. pylori. Однак роль джгутиків у опосередкуванні адгезії потребує вивчення. В експерименті отримані дані про зв’язок між рухливістю штамів H. pylori та ступенем колонізації шлунка. Гени, що кодують структурні субодиниці білків флагелінів, нині клоновані та секвеновані [11].

Важливий фактор вірулентності H. pylori – висока уреазна активність. Уреаза вважається вірулентною детермінантою, яка опосередковує як бактеріальну адгезію, так і цитопатичну дію H. pylori [16].

Перелічені чинники вірулентності H. pylori як опосередковують прояв агресивних властивостей бактерії, а й служать стимуляторами інтенсивного імунологічного відповіді організму інфікованого господаря. Вивчення системної імунологічної відповіді пацієнтів із H. pylori-асоційованою патологією може дати цінні результати для прогнозу захворювання.

Останнім часом розроблено методи серологічного виявлення антитіл до широкого спектру антигенів H. pylori, зокрема до VacA і CagA, – протеїнів, теплошокових протеїнів, джгутикових та уреазних антигенів тощо. Одним з найбільш поширених методів подібного імунологічного моніторингу є метод Western blot аналізу, з допомогою якого проведено даний дослідження.

Мета нашого дослідження – вивчити серологічну відповідь до різних антигенів H. pylori та вираженість атрофічних змін слизової оболонки шлунка при хронічному H. pylori-асоційованому гастриті залежно від серотипу інфікуючого мікроорганізму.

Матеріал та методи дослідження

Досліджено 18 пацієнтів з H. pylori-асоційованим гастритом, у яких виконано ендоскопію з прицільною біопсією слизової оболонки шлунка з тіла та антрального відділу.

У гістологічних препаратах, забарвлених гематоксиліном та еозином, за методом Гімзи, та за допомогою PAS-реакції оцінювали обсімененість H. pylori, характер патологічного процесу (гастрит, наявність та вираженість атрофії слизової оболонки).

В сыворотке крови методом Western blot анализа определяли наличие специфических IgG к 6 белковым антигенам H. pylori с различной молекулярной массой: к антигену CagA (116 кДа), VacA (89 кДа), жгутиковому антигену массой 35 кДа и уреазоассоциированным протеинам Н, А, Е массой соответственно 30, 26,5 и 19,5 кДа.

В качестве тест-системы применяли набор реагентов “Helico Blot 2.0” (Genelabs Diagnostics). В качестве антигена использовали лизат штамма H. pylori. Белки лизата после электрофоретического разделения наносили на нитроцеллюлозные мембраны. Их полоски инкубировали с предварительно разведенными образцами сывороток. Специфические антитела связывались с антигенами полосок. После отмывки и удаления не связавшихся антител полоски обрабатывали раствором конъюгата (для связывания специфических антител комплекса, сформированного на тестовой мембране).

Визуализацию образованных комплексов проводили с помощью BCIP/NBT cубстрата – 5-бром-4-хлороиндолилфосфата (BCIP) и нитросинего тетразолия (NBT).

Результат реакции считали положительным, если на тестовой мембране присутствовала одна из полос 116, 89, 35 и/или две полосы 30, 26,5 и 19,5 кДа. Отрицательным оценивали результат, если на тестовой мембране не “проявлялось” ни одной специфической полосы или проявленные полосы не удовлетворяли критериям положительного образца.

В зависимости от результатов серологического исследования инфицирующие микроорганизмы подразделялись на 4 серотипа: тип I (CagA+; VacA+), тип Iа (CagA+; VacA-), тип Ib (CagA-; VacA+) и тип II (CagA-; VacA-). Результаты Western blot анализа обрабатывали с помощью специальной программы “AutoScan”, позволяющей получать графическое изображение антигенного профиля инфицирующего микроорганизма и определить соответствующий серотип (рис. 1).

Результати дослідження

Обсімененість H. pylori слизової оболонки шлунка в середньому склала: 1,76±0,16 – у тілі та 2,02±0,15 – в антральному відділі.

При гістологічному дослідженні зразків слизової оболонки, взятих із тіла шлунка, атрофічні зміни виявлено у 55,6% пацієнтів. З них у половини атрофічні зміни оцінені як слабкі та в іншої половини – як помірні. При слабкій атрофії слизової оболонки тіла шлунка анти-CagA-антитіла виявлено у 80% пацієнтів, анти-VacA – у 60%, антитіла до протеїнів масою 35, 30, 26,5 та 19,5 кДа – відповідно у 40, 80, 80 та 20%. При помірній атрофії слизової оболонки тіла шлунка анти-CagA-антитіла виявлено у 80% хворих, анти-VacA – у 60%, антитіла до протеїнів масою 35, 30, 26,5 та 19,5 кДа – відповідно у 80, 80, 60 та 20%.

Результати гістологічного дослідження зразків слизової оболонки з антрального відділу шлунка показали, що атрофічні зміни є у 667% пацієнтів, з них у 583% вони оцінені нами як слабкі, у 417% – як помірні.

При слабкій атрофії слизової оболонки антрального відділу шлунка анти-CagA-антитіла були у 85,7% пацієнтів, анти-VacA – у 71,4%, антитіла до протеїнів масою 35, 30, 26,5 та 19,5 кДа – відповідно у 42,9, 85,7, 71,4 та 57,1%. Помірна атрофія слизової оболонки антрального відділу шлунка супроводжувалася наявністю анти-CagA-антитіл у 80% хворих, анти-VacA – у 60%, антитіл до протеїнів масою 35, 30, 26,5 та 19,5 кДа – відповідно у 80, 80, 80 та 0%.

Результати виявлення сироваткових антитіл до різних антигенів H. pylori в залежності від ступеня атрофії слизової оболонки шлунка представлені в таблиці. 1.

Найчастіше (55,5%) виявлялися H. pylori I серотипу. Мікроорганізми Ia серотипу виявлено у 33,3% пацієнтів, Ib та II серотипів однаково рідко (у 5,6%). У 40% пацієнтів зі слабкою атрофією слизової оболонки тіла шлунка виявлені сироваткові антитіла до H. pylori I серотипу, у 40% – до H. pylori Iа серотипу, у 20% – до H. pylori II серотипу. У 40% хворих з помірною атрофією слизової оболонки тіла шлунка виявлені сироваткові антитіла до H. pylori I серотипу, у 40% – до H. pylori Iа серотипу, у 20% – до H. pylori Ib серотипу.

При гістологічному дослідженні зразків слизової оболонки, взятої з антрального відділу шлунка, атрофічні зміни виявлено у 667% пацієнтів, з них у 583% вони оцінені як слабкі, у 417% – як помірні.

При слабкій атрофії слизової оболонки антрального відділу шлунка 71,4% пацієнтів виявилися інфікованими H. pylori I серотипу, 14,3% – H. pylori Iа серотипу, 14,3% – H. pylori II серотипу. При помірній атрофії слизової оболонки антрального відділу шлунка у 40% хворих виявлені сироваткові антитіла до H. pylori I серотипу, у 40% – до H. pylori Iа серотипу, у 20% – до H. pylori Ib серотипу.

Дані про рівень вираженості атрофії слизової оболонки шлунка у пацієнтів з хронічним гастритом, інфікованих різними серотипами H. pylori, наведено в табл. 2.

Обговорення результатів дослідження

Незважаючи на велику кількість досліджень H. pylori та асоційованої патології, залишається без відповіді головне питання – чи здатна виникає в результаті інфікування імунна відповідь запобігти розвитку тяжких ушкоджень слизової оболонки шлунка та дванадцятипалої кишки, забезпечити елімінацію збудника та запобігання повторному зараженню після ерадику?

Друга сторона цього питання – можливість профілактики H. pylori-асоційованих захворювань на імунізацію з використанням у складі вакцини найбільш імуногенних компонентів H. pylori.

Швидше за все природне інфікування організму господаря не призводить до індукції реакції у відповідь, здатної запобігти розвитку різноманітних наслідків впливу бактеріальних факторів. Тим не менш, на мишачих моделях гелікобактерної інфекції вдалося досягти за допомогою оральної імунізації лізатами або очищеними рекомбінантними антигенами H. pylori протективного імунологічного ефекту [15]. Крім того, продемонстровано можливість імунізації мишей з хронічною інфекцією H. felis, елімінації збудника та захисту від подальшого інфікування [2].

Подібні результати продемонстровані у тхорів, інфікованих H. mustelae [6]. Природа протективної імунної відповіді на інфікування H. pylori остаточно не розкрита. Показано, що виникнення імунологічного захисту після імунізації уреазою H. pylori корелює зі збільшенням рівня шлункових уреазоспецифічних IgA [10].

З іншого боку, не відзначено відмінностей чутливості до інфікування або характеру вираженості патології, що виникає, між звичайними та IgA-дефіцитними пацієнтами, інфікованими H. pylori [1]. Крім того, у IgA-дефіцитних мишей після імунізації антигенами H. pylori спостерігалася індукція протективної імунної відповіді [13]. Ключ до розуміння індукції імунологічного захисту проти H. pylori може надати вивчення спроб імунізації з використанням потужних ад’ювантів. Усі успішні спроби імунізації проти H. pylori пов’язані з використанням холерного токсину або термолабільного токсину ентеропатогенної E. coli як ад’юванта. Зазначені субстрати, як показали McGhee та співавт. [12, 17], індукують Th2-опосередковані імунні реакції.

З відкриттям острівця патогенності в геномі штамів H. pylori I серотипу та встановленням функціональної характеристики генів, що входять до його складу, з’явився новий погляд на механізми взаємодії H. pylori з організмом господаря [3]. контактуючи з епітеліоцитами, штами H. pylori I серотипу, що містять острівець патогенності, індукують вироблення IL-8, потужного хемоаттрактанту для нейтрофільних лейкоцитів. Крім цього, контакт із епітеліоцитами сприяє вивільненню бактеріальних факторів. Одним з них є цитотоксин VacA, що забезпечує вакуолізацію епітеліальних клітин, що веде до їх загибелі і до виразки слизової оболонки.

Біологічно активний VacA експресується лише штамами H. pylori I серотипу. Антигени H. pylori, що долають епітеліальний бар’єр шлунка, активують макрофаги, тим самим індукуючи подальше вироблення низки прозапальних цитокінів – IL-8, IL-6, IL-1, IL-12 [20].

IL-12 сприяє індукції Th1 – імунної відповіді. Причому більшість клонів Th1-лімфоцитів, ізольованих від пацієнтів з виразкою, є антигеноспецифічними щодо CagA, який також експресується тільки штамами H. pylori I типу [7].

Th1-лімфоцити виробляють такі прозапальні цитокіни, як TNF-a та IFN-g, що сприяють розвитку гастриту. Подібні ефекти можуть пояснити вищу патогенність штамів H. pylori I серотипу.

Результати нашого дослідження стосувалися деяких сторін гуморальної імунної відповіді на інфікування H. pylori, насамперед утворення сироваткових IgG проти низки антигенів H. pylori. За нашими даними, розвиток більш важких атрофічних змін слизової оболонки шлунка у H. pylori-інфікованих пацієнтів поєднувався з виявленням у сироватці крові антитіл класу IgG до цитотоксину VacA та цитотоксинасоційованого протеїну CagA, що відповідало інфікуванню H. pylori сероти.

Крім того, отримані нами дані свідчать також про виникнення імунної відповіді на уреазоасоційовані та джгутикові антигени H. pylori у даних пацієнтів. Наявність у сироватці крові антитіл до джгутикового антигену та уреазоасоційованих антигенів urease Н та А поєднувалося з високою частотою розвитку атрофії слизової оболонки шлунка. Цього не спостерігалося щодо уреазоасоційованого антигену urease Е. Не виключено, однак, що останній антиген H. pylori має низьку імуногенність, внаслідок чого специфічні антитіла до цього антигену не виявлялися з високою частотою.

Подальші дослідження особливостей імунологічної відповіді у пацієнтів з H. pylori-асоційованими захворюваннями сприятимуть оптимізації діагностики, лікування, а також, можливо, профілактики цієї серйозної патології.

Висновки

1. У хворих на хронічний H. pylori-асоційований гастрит найбільш постійно атрофія слизової оболонки розвивається при інфікуванні H. pylori I та Iа серотипів. Найбільший ступінь виразності атрофічних змін відзначається при інфікуванні H. pylori I, Iа та Ib серотипів, що відображає високу патогенність мікроорганізмів, здатних до вироблення антигенів VacA та CagA.
2. Найчастіше атрофія слизової оболонки шлунка при H. pylori-позитивному хронічному гастриті спостерігається за наявності сироваткових антитіл до бактеріального цитотоксинасоційованого антигену CagA, джгутикового антигену і уреазоасоційованих антигенів urease Н і А, що може відображати антіаген.
3. Рідше атрофія слизової оболонки шлунка при H. pylori-позитивному хронічному гастриті виникає за наявності антитіл до бактеріального уреазоасоційованого антигену urease Е, що свідчить проти участі даного бактеріального антигену у розвитку запального ушкодження слизової оболонки.
4. Антигени H. pylori мають неоднакову імуногенність. Цю обставину необхідно враховувати при розробці діагностичних тест-систем для імунологічної діагностики H. pylori-інфекції та при створенні імунологічних препаратів для лікування та профілактики асоційованої патології.

Список літератури

1. Bogstedt A.K., Nava S., Wadstrom T., Hammarstrom L. Helicobacter pylori infections in IgA deficiency: lack of role for the secretory immune system // Clin. exp. Immunol. – 1996. – Vol. 105. – P. 202-204.
2. Corthesy-Theulaz I., Porta N., Glauser M. et al. Oral immunization with Helicobacter pylori urease B subunit as a treatment against Helicobacter infection in mice // Gastroenterology. – 1995. – Vol. 109. – P. 115-121.
3. Covacci A., Falkow S., Berg D.E., Rappuoli R. Did the inheritance of a pathogenicity island modify the virulence of Helicobacter pylori? // Trends Microbiol. – 1997. – Vol. 5. – P. 205-208.
4. Cover T.L., Glupczynski Y., Lage A.P. et al. Serologic detection of infection with cagA+ Helicobacter pylori strains // J. clin. Microbiol. – 1995. – Vol. 33. – P. 1496-500.
5. Cover T.L., Reddy L.Y., Blaser M.J. Effects of ATPase inhibitors on the response of HeLa cells to Helicobacter pylori vacuolating toxin // Infect. Immun. – 1993. – Vol. 61. – P. 1427-1431.
6. Cuenca R., Blanchard T.G., Czinn S.J. et al. Therapeutic immunization against Helicobacter mustelae in naturally infected ferrets // Gastroenterology. – 1996. – Vol. 110. – P. 1770-1775.
7. D’Elios M.M., Manghetti M., DeCarli M. et al. T helper 1 effector cells specific forHelicobacter pylori in the gastric antrum of patients with peptic ulcer disease // J. Immunol. – 1997. – Vol. 158. – P. 962-967.
8. Graham D., Yamaoka Y. Disease-specificHelicobacter pylori virulence factors: the unfulfilled promise // Helicobacter. – 2000. – Vol. 5, suppl. 1. – P. S3-S9.
9. Howden C.W. Clinical Expressions of Helicobacter pylori Infection // Amer. J. Med. – 1996. – Vol. 100. – P. 27S-34S.
10. Lee C.K., Weltzin R., Thomas W.D. et al. Oral immunization with recombinant Helicobacter pylori urease induces secretory IgA antibodies and protects mice from challenge with Helicobacter felis // J. infect. Dis. – 1995. – Vol. 172. – P. 161-172.
11. Leying H., Suerbaum S., Geis G., Haas R. Cloning and the genetic characterization of a Helicobacter pylori flagellin gene // Molec. Microbiol. – 1992. – Vol. 6. – P. 2863-2874.
12. Marinaro M., Staats H.F., Hiroi T. et al. Mucosal adjuvant effect of cholera toxin in mice results from induction of T helper 2 (Th2) cells and IL-4 // J. Immunol. – 1995. – Vol. 155. – P. 4621-4629.
13. Nedrud T., Blanchard S., Czinn G.R., Harriman G.R. Orally immunized IgA-deficient mice are protected against H. felis infection (abstract) // Gut. – 1996. – Vol. 39, suppl. 2. – A45.
14. Peek R.M., Thompson S.A., Donahue J.P. et al. Adherence to gastric epithelial cells induces expression of a Helicobacter pylori gene, iceA, that is associated with clinical outcome // Proc. Assoc. Amer. Phys. – 1998. – Vol. 110. – P. 531-544.
15. Radcliff F.J., Chen M.H., Lee A. Protective immunization against Helicobacter stimulates long term immunity // Vaccine. – 1996. – Vol. 14. – P. 780-784.
16. Suzuki J., Muraoka H., Ohnishi H. et al. Evidence of colonization of urease negative variants ofHelicobacter pylori in Mongolian gerbils // Gastroenterology. – 1999. – Vol. 116. – A324.
17. Takahashi I., Marinaro M., Kiyono H. et al. Mechanisms for mucosal immunogenicity and adjuvancy of Escherichia coli labile toxin // J. infect. Dis. – 1996. – Vol. 173. – P. 627-635.
18. Van Doorn L.J., Figueriedo C., Sanna R. et al. Clinical relevance of the cagA, vacA and iceA status of Helicobacter pylori // Gastroenterology. – 1998. – Vol. 115. – P. 58-66.
19. Yamaoka Y., Kodama T., Gutierrez O. et al. Relationship betweenHelicobacter pylori iceA, cagA and vacA status and clinical outcome: studies in four different countries // J. clin. Microbiol. – 1999. – Vol. 37. – P. 2274-2279.
20. Yamaoka Y., Kodama T., Kita M. et al. Relations between clinical presentation, Helicobacter pylori density, interleukin-1b and -8 production and cagA-status // Gut. – 1999. – Vol. 45. – P. 804-811.